О новой работе российских ученых, которая вышла в престижном научном журнале PNAS и посвящена генетической регуляции, рассказал один из ее авторов — заведующий лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов Института молекулярной генетики Российской академии наук Андрей Кульбачинский.
— Чему посвящена ваша работа?
РНК-полимераза — фермент, осуществляющий транскрипцию, синтез РНК на ДНК-матрице. В клетках эукариот и прокариот работа данного фермента подвергается сложной регуляции как малыми молекулами, так и специальными белками (транскрипционными факторами). В случае заражения бактерии вирусом (бактериофагом или, кратко, фагом) происходит переключение экспрессии клеточных генов на нужды бактериофага. Для этого бактериофаги используют целый арсенал средств — свою собственную РНК-полимеразу, а также белки, модулирующие работу бактериальной РНК-полимеразы хозяйской клетки.
В нашем случае мы исследовали регуляцию транскрипции РНК-полимеразы бактерии Xanthomonas oryzae (широко распространенный растительный патоген) небольшим белком р7 бактериофага Хр10. Уникальность данного белка заключается в комбинировании двух факторов: во-первых, белок р7 в отличие от большинства других регуляторов транскрипции фаговой природы способен влиять не на одну, а на все стадии транскрипции (инициация, элонгация и терминация синтеза РНК, осуществляемые бактериальной РНК-полимеразой); во-вторых, данный белок имеет очень небольшие размеры (он меньше бактериальной РНК-полимеразы в 45 раз).
Как такому маленькому белку удается так много? Во время фаговой инфекции белок р7 ингибирует инициацию транскрипции на клеточных промоторах (тем самым обеспечивая экспрессию генов бактериофага), а также способствует прохождению РНК-полимеразой сайтов терминации (где она в норме прекращает синтез РНК). Таким образом, складывается довольно необычная ситуация: РНК-полимераза в присутствии белка р7 не может начать синтез РНК, но если уже начала, то не может остановиться. Биологическая роль данного явления может быть объяснена наличием сигналов терминации в фаговой ДНК, которые должны быть успешно пройдены бактериальной РНК-полимеразой на определенной стадии инфекции.
Наше исследование было направлено на изучение механизма р7-зависимой антитерминации, благодаря которому в присутствии белка р7 клеточная РНК-полимераза становится нечувствительной к сигналам остановок. Было обнаружено несколько удивительных фактов. Во-первых, нами было показано, что в модуляции белком р7 инициации и терминации транскрипции задействованы разные участки бактериальной РНК-полимеразы. Во-вторых, оказалось, что для антитерминаторной активности белка р7 необходима самая маленькая субъединица бактериальной РНК-полимеразы — омега, которая ко всему прочему является и самой малоизученной. В целом обнаруженный нами механизм действия р7 на терминацию транскрипции можно объяснить подавлением образования пауз транскрипции, что также происходит и во время окончания синтеза РНК.
РНК затем используется в качестве инструкции для синтеза молекул белка.
Транскрипция — одна из основных стадий регуляции активности генов. Переключение активности индивидуальных генов в составе генома необходимо для нормального развития клеток и целых организмов и их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды.
При этом само явление переключения генов было впервые открыто еще на заре молекулярной генетики на примере бактериофагов — так называют вирусы, которые способны заражать бактерии и приводить к их гибели: из-за относительной простоты строения своего генома бактериофаги служат классическим объектом для исследований механизмов генетической регуляции.
Замечательно, что это открытие — изменение активности генов в ходе заражения бактерии бактериофагом — было сделано в самом начале 1960-х годов в нашей стране под руководством выдающегося ученого, одного из основателей молекулярной генетики Романа Бениаминовича Хесина.
Именно его работы заложили основы нескольким направлениям исследований в области генетической регуляции, которые успешно развиваются его учениками у нас в стране и в мире.
— Опубликованная нами работа посвящена как раз механизмам такой регуляции. Синтезом РНК в клетках всех организмов занимается специальный фермент — РНК-полимераза. Бактериофаги часто используют РНК-полимеразу клеток бактерий для своих нужд, чтобы синтезировать РНК-копии собственных генов. Но как заставить ее это делать?
Мы исследовали механизмы такого переключения активности РНК-полимеразы на примере одного из бактериофагов, который заражает бактерию — вредителя риса.
Этот бактериофаг интересен еще и тем, что может быть использован для борьбы с бактериальными инфекциями растений.
Оказалось, что в геноме бактериофага закодирован маленький белок, который связывается с РНК-полимеразой клетки-хозяина и полностью меняет ее свойства: РНК-полимераза перестает «читать» собственные гены клетки, но при этом становится активнее в чтении генов бактериофага.
В частности, РНК-полимераза перестает видеть «знаки препинания» в ДНК бактериофага и в том месте, где должна быть остановка (терминация) транскрипции, продолжает синтез — такое явление получило название антитерминации. Это позволяет получить РНК-копии тех генов, которые находятся после сигналов остановки. Мы смогли установить механизм антитерминации и нашли мишень для действия данного белка на поверхности молекулы РНК-полимеразы.
Так как структура РНК-полимеразы в целом похожа у всех организмов, включая человека, можно предположить, что сходные механизмы регуляции действуют и у нас с вами.
— Работа была проведена с использованием классических методов молекулярной биологии и биохимии. Мы получили много вариантов РНК-полимеразы с различными мутациями, исследовали их активность на разных стадиях синтеза РНК. Основная часть работы посвящена тому, как РНК-полимераза узнает различные сигналы («дорожные знаки») в ходе своего движения по молекуле ДНК и как на это могут влиять взаимодействия с регуляторными белками бактерий и бактериофагов.
— Как выводы, приведенные в статье, помогут биологам?
— Цель наших исследований — понять универсальные механизмы регуляции активности генов, в данном случае на примере РНК-полимеразы бактерий. Надо сказать, что в настоящее время есть всего несколько примеров белков — регуляторов транскрипции, для которых известны молекулярные механизмы переключения активности РНК-полимеразы.
Описанный нами механизм отличается от известных примеров и расширяет наши представления о том, как регулируется активность одного из ключевых ферментов, участвующих в работе генома.
— Какие перспективы у направления, которому посвящена данная работа?
— Исследования механизмов регуляции транскрипции — одно из важнейших направлений современной биологии. В области бактериальной транскрипции подобные исследования помогут детально выяснить тонкие молекулярные механизмы работы РНК-полимеразы и принципы регуляции транскрипции на уровне целых геномов.
Не стоит забывать и о том, что РНК-полимераза — перспективная мишень для поиска новых антибиотиков, так что понимание механизмов ее работы необходимо для борьбы с инфекциями.
— Где проводились изыскания?
— Все эксперименты, вошедшие в эту публикацию, непосредственно выполнены в Институте молекулярной генетики Российской академии наук — в том же месте, что и первые исследования Р.Б. Хесина по регуляции активности генов бактериофагов.
