Изучение механизмов взаимодействия природных соединений, в первую очередь белков, все сильнее волнует ученых, и во многом такой интерес обусловлен желанием разрабатывать новые лекарственные препараты. Известно, что белок может в ходе реакции и образования комплекса с другим белком довольно сильно менять свою конформацию, причем конформация эта оказывается зависимой от структуры второй молекулы, вступающей в реакцию, – один и тот же белок в зависимости от условий реакции может вступать во взаимодействие с несколькими десятками типов молекул.
Как осуществляются такие метаморфозы, ученые до сих пор не знают наверняка. Наиболее общепринятой теорией, описывающей взаимодействие двух белковых молекул, является гипотеза так называемого «наведенного соответствия», когда конформация одной молекулы в ходе реакции подстраивается под конформацию другой. Эта теория доминировала в учебниках по химии природных соединений в течение полувека, однако в последнее время все большую силу набирают альтернативные точки зрения.
Экспериментальные факты, подкрепленные кинетическими и структурными данными, заставляют ученых все чаще обращаться к так называемой теории «конформационной селекции».
геометрические формы, которые могут принимать молекулы органических соединений при вращении атомов или групп атомов (заместителей) вокруг простых связей при сохранении неизменным порядка химической связи атомов (химического строения), длины связей и валентных углов. Молекулы, отличающиеся только своей конформацией, называют поворотными изомерами (конформерами).
Поэтому в стационарном состоянии существует некоторое термодинамическое равновесие между различными конформациями одного и того же белка. В реакцию с другими белками вступают молекулы с термодинамически не самой выгодной конформацией, однако протекание этой реакции постепенно смещает кинетическое равновесие в сторону образования именно этого варианта. В результате очень скоро молекулярный комплекс двух белковых молекул становится доминирующей формой их существования.
Эта теория всем хороша и на бумаге выглядит довольно стройно, однако в мире науки ничто не принимается на веру. Так, теория «наведенного соответствия» родилась из простого наблюдения структуры белка в комплексе, отличной от его структуры в растворе. Чтобы же доказать теорию «конформационной селекции», необходимо увидеть все возможные конформации белка еще до образования им устойчивого комплекса с другими молекулами.
Об это препятствие и спотыкалась теория в последнее время. Дело в том, что основные структурные данные о белковых конформациях ученые получают из кристаллографических исследований не индивидуальных белков, а белковых комплексов, которые более склонны к образованию кристаллов.
«Пощупать» короткоживущие конформации белка можно только с помощью технологии ЯМР-релаксационной спектроскопии.
Этот метод позволяет увидеть белковые молекулы в динамике – при переходе от одной конформации к другой.
Однако до последнего времени его можно было применить только к очень быстрым переходам между короткоживущими конформациями в диапазоне наносекунд и к сравнительно медленным переходам в миллисекундном диапазоне. Превращения молекулы в наносекундном диапазоне можно наблюдать благодаря вращательным колебаниям связей в молекулах белков, которые проявляются в виде нескольких типов расчетных параметров ЯМР-спектра, а конформационная неоднородность в миллисекундном диапазоне проявляется напрямую в виде расщепления пиков в ЯМР-спектре.
Этих возможностей Микеле Вендрусколо оказалось достаточно, чтобы показать наличие нескольких конформаций белка убиквитина в растворе, находящихся в термодинамическом равновесии. Соответствующая статья вышла в журнале Nature ещё в 2005 году.
Убиквитин был выбран для проверки теории «конформационной селекции» не случайно. В настоящее время известно, что этот белок входит в состав нескольких сигнальных цепей и специфически взаимодействует с многими белковыми молекулами. Ученым известно 46 различных по структуре молекулярных комплексов убиквитина с другими молекулами! Часть из этих конформаций, свободно плавающих в растворе, и увидел Вендрусколо.
(от латинского «вездесущий») – белок, присутствующий в клетках живого организма. открытый в 1970-х годах американским биохимиком Голдстейном. Молекулы этого белка собраны из 76 аминокислотных остатков, его молекулярная масса сравнительно невелика, немногим более 8 тысяч, он стабилен и участие в различных биохимических процессах не приводит к изменению его структуры. Несмотря на то, что убиквитин находили во многих клетках живых организмов, и строение его было установлено, роль его в биохимических процессах была не ясна. Широко известным этот белок стал благодаря совместной работе биохимиков Роуза (США), Хершко (Израиль) и Кичановера (Израиль), получивших за эти работы Нобелевскую премию по химии 2004 года
В живом организме идут хорошо отлаженные процессы расщепления белков на малые фрагменты, из которых организм затем вновь собирает в рибосоме другие нужные ему белки. Если фабрика по производству белков – это рибосома, то фабрику, разрушающую белки, называют протеасомой, (так же, как и рибосома, она представляет собой специальное белковое образование – биологический комплекс в виде емкости цилиндрической формы, собранной из колец). Внутри расположен канал, на поверхности которого находятся активные центры, расщепляющие белки. Снаружи этот канал закрыт торцевыми подвижными крышками. В каждой клетке находится несколько тысяч протеасом, и все они предназначены для расщепления белка.
Долгое время считалось, что попасть белковой молекуле в этот «утилизирующий контейнер» довольно просто, но тогда любой белок, в том числе и нужный, попавший во «чрево» протеасомы, уничтожался бы. Тем не менее, было неясно, почему туда попадает не любой, а строго определенный белок, именно тот, который следует утилизировать. При детальном изучении этого явления было установлено, что белки в клетке разрушаются в присутствии еще одного белка, обладающего высокой активностью. Оказалось, что это как раз убиквитин, роль которого в биохимических процессах была неясна.
Было установлено, что решающая стадия в процессе утилизации белков – присоединение убиквитина к тому белку, который нужно уничтожить. Кроме того, обнаружилось, что вход в протеасому обычно закрыт, и попасть в нее может только белок, отмеченный специальной меткой – в этом случае вход в протеасому открывается. Роль такой «черной» метки играет убиквитин. Этот процесс прикрепления убиквитина к молекуле белка, подлежащего ликвидации, авторы назвали «поцелуем смерти». Входя в протеасому, полимерная цепь уничтожаемого белка разворачивается и «протягивается» через центральный канал цилиндра, при этом она гидролизуется и распадается на мелкие звенья (иногда вплоть до отдельных аминокислот), которые выводятся из противоположного отверстия протеасомы. Сам убиквитин внутрь протеасомы не заходит, а после уничтожения отмеченной молекулы освобождается и начинает метить другую молекулу.
Разработанный убиквитиновый механизм открывает новые перспективы в борьбе с различными заболеваниями. Образование злокачественных образований или ослабление иммунной системы клетки связаны с нарушением убиквитиновой защиты клетки от нежелательных белков. Процессы ненормального или неправильного расщепления белков приводят ко многим заболеваниям (например, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, некоторые онкологические заболевания) и связаны с процессами старения организма. Изученный механизм убиквитиновой защиты открывает возможность поиска различных воздействий на этот механизм, чтобы запускать его в нужную сторону.
Однако для того, чтобы подтвердить справедливость теории «конформационной селекции», необходимо было зафиксировать переходы между всеми 46 конформациями, время жизни многих из которых находилось в недоступном для метода ЯМР-релаксации микросекундном диапазоне.
Впервые увидеть и описать их структуру удалось Кристиану Гризингеру и Берту де Гроту из Института биофизической химии имени Макса Планка в Гёттингене. Свою пионерскую работу, которая должна лечь в основу новой теории взаимодействия белковых молекул, ученые и их коллеги представили в журнале Science.
Ученым удалось расширить временные рамки метода с помощью так называемых остаточных дипольных взаимодействий (RDC, residual dipolar coupling).
Они проявляются в том случае, если молекулы белков помещаются в так называемый анизотропный раствор – сильно разбавленный раствор молекул, формирующих жидкие кристаллы, или полиакриламидный гель. В этом случае различные типы взаимной ориентации белков не являются равновероятными, а потому вращательные колебания связей между атомами в молекуле и молекулярном комплексе не усредняют измеряемую величину диполь-дипольного взаимодействия до нуля. Поэтому с помощью метода ЯМР-релаксации становятся видны медленные переходы между конформациями белковых молекул, так как в случае возникновения остаточного диполь-дипольного взаимодействия их, грубо говоря, «не скрывают» быстрые вращательные деформации молекулы.
Гризингеру и де Гроту удалось увидеть все 46 конформаций белковой молекулы убиквитина, находящихся в растворе в термодинамическом равновесии между собой.
skin: article/incut(default)
data:
{
"_essence": "test",
"incutNum": 1,
"pic_fsize": "70033",
"picsrc": "Формирование белкового комплекса в соответствии с теорией \"наведенного соответствия\" (верхняя часть рисунка), и \"конформационной селекции\" (нижняя часть рисунка), где различные по форме фигуры отражают различные конформации одной и той же белковой молекулы. // AAAS/Science",
"repl": "<1>:{{incut1()}}",
"uid": "_uid_2782121_i_1"
}
Кроме того, расчет структурных параметров молекулы убиквитина во вновь обнаруженных конформациях показал некоторое их отличие от структуры в готовых молекулярных комплексах с другими белковыми молекулами. Это значит, что теория «индуцированного соответствия» и теория «конформационной селекции», скорее всего, отражают крайние позиции в реальном механизме взаимодействия белков.
Скорее всего, реальный механизм взаимодействия включает три последовательных стадии:
1) стадию диффузионного сближения взаимодействующих молекул;
2) стадию селекционного отбора на первом этапе взаимодействия белковых молекул;
3) стадию индуцированного соответствия и конформационной релаксации системы двух молекул в окончательно связанную форму, когда первичный отбор комплементарной структуры уже произошел и требуется только её окончательная подгонка.
Разумеется, работа биохимика имеет свей целью лишь подтвердить справедливость позиций теории «конформационной селекции». Дальнейшее развитие представлений о механизмах взаимодействия белковых молекул потребует и уточнения величины энергетических барьеров между конформациями молекул, и выяснения их природы, и сопоставления кинетических данных со структурными для большей полноты картины.
Однако уже сейчас вопрос о механизме взаимодействия белковых молекул можно расширить и задаться выяснением роли такой динамики белковых молекул в эволюции белков.
Развилась ли способность перехода между различными по структуре конформациями для взаимодействия с различными белковыми молекулами, или наоборот, новые возможности для взаимодействия возникли благодаря динамической структуре глобулярного белка? Если верно второе, то новые химические реакции, в которые оказался способен вступать убиквитин, не потребовали от него изменения оригинальной структуры и свойств.
Дальнейшее изучение конформационной неоднородности других белковых молекул не только позволит дать ответ на вопросы об эволюции молекул, но также откроет пути для создания искусственных белковых молекул и создания новых типов лекарственных препаратов.
