Перевари себя сам

Детализирован патогенез острого «алкогольного» панкреатита

Избыток этилового спирта заставляет поджелудочную железу переваривать себя — если вовремя не сделать операцию, то за сутки жизненно важный орган может превратиться в кашицу. Теперь ученые выяснили пусковой фактор этого процесса, что рано или поздно сделает это заболевание менее смертельным.

Несколько тысяч лет употребления и злоупотребления алкоголем разделили даже научное сообщество на два лагеря: первые упорно ищут положительные эффекты, вторые — детализируют отрицательные. Итог неутешителен: никакое антибактериальное действие или улучшение работы сердечно-сосудистой системы не способно компенсировать огромное количество неврологических расстройств, поражений печени и других «побочных эффектов».

Особое место среди последних занимает панкреатит – воспаление поджелудочной железы, у которого есть две основные причины – закупоривание выводных протоков камнем и, собственно, алкоголизм. Причем, в отличие от того же цирроза печени, при котором спирт выступает в роли обычного яда, в случае панкреатита алкоголь действует адресно, нарушая лишь некоторые аспекты работы клеток именно поджелудочной железы.

Юлия Герасименко и её коллеги из Университета Ливерпуля установили недостающие элементы этого процесса, на которые при должном старании можно найти фармакологическую управу.

Острый панкреатит

остро протекающее асептическое воспаление поджелудочной железы демаркационного типа, в основе которого лежат некробиоз панкреатоцитов и ферментная аутоагрессия с последующим некрозом и дистрофией железы и присоединением вторичной гнойной инфекции. Летальность, несмотря на применение современных методик консервативного и оперативного лечения, высокая: общая 7-15%, при деструктивных формах — 40-70%.

Примерно 70% случаев обусловлено употреблением алкоголя, 25-30% случаев — заболеваниями желчевыводящих путей, в том числе желчекаменной болезнью. 4-9% случаев – вовлечение поджелудочной железы в воспаление при острых заболеваниях органов брюшной полости. Также причинами панкреатита могут быть отравления, травмы, вирусные заболевания, операции и эндоскопические манипуляции.

Острый панкреатит представляет собой токсическую энзимопатию. Пусковым механизмом развития является высвобождение из ацинарных клеток поджелудочной железы активированных панкреатических ферментов, обычно присутствующих в виде неактивных проферментов.

Развитие панкреатита ведет к самоперевариванию железы. Его осуществляют липолитические ферменты — фосфолипаза А и липаза, которые выделяются железой в активном состоянии.

Липаза поджелудочной железы не повреждает только здоровые клетки железы. Фосфолипаза А разрушает клеточные мембраны и способствует проникновению в клетку липазы. Освобождение тканевой липазы, которая усиливает расщепление липидов (в том числе липидов клеточной мембраны), ускоряет деструктивные процессы. Из накапливающихся в очаге воспаления ферментов в особенности выраженным деструктивным действием обладает эластаза гранулоцитов.

В результате возникают очаги жирового панкреонекробиоза. Вокруг них в результате воспалительного процесса формируется демаркационный вал, отграничивающий их от неповрежденной ткани. Если патобиохимический процесс ограничивается этим, то формируется жировой панкреонекроз. Если в результате накопления в поврежденных липазой панкреатоцитах свободных жирных кислот рН сдвигается до 3,5-4,5, то внутриклеточный трипсиноген трансформируется в трипсин.

Трипсин активирует лизосомные ферменты и протеиназы, что ведет к протеолитическому некробиозу панкреатоцитов. Эластаза лизирует стенки сосудов, междольковые соединительно-тканные перемычки. Это способствует быстрому распространению ферментного аутолиза (самопереваривания) в поджелудочной железе и за ее пределами.

В конечном счете главным механизмом развития острого панкреатита служит преждевременная активация панкреатических ферментов. Под действием трипсина активизируются все зимогены ферментов поджелудочной железы (эластазы, карбоксипептидазы, химотрипсина, фосфолипазы, колипазы), калликреин-кининовая система, изменяется фибринолиз и свертываемость крови, что приводит к местным и общим патобиохимическим расстройствам. Кроме местных нарушений, связанных с патологическим процессом в самой железе, наблюдается общий интоксикационный процесс, приводящий к поражению почек, легких, печени, сердца.

Несмотря на все старания врачей и достижения хирургии, летальность острого панкреатита достигает 15%, а его деструктивных форм – 70%. Эти цифры не кажутся такими уж запредельными, если представить себе всю ту ферментную «мощь», которая выходит наружу при повреждении поджелудочной железы. Ведь именно её ферментам, выделяющимся в просвет двенадцатиперстной кишки, мы обязаны столь эффективным перевариванием углеводов и белков.

В клетках поджелудочной железы здорового организма синтезируются предшественники ферментов – например, трипсиноген, который только в просвете кишечника превращается в трипсин, обладающий протеолитической активностью. К счастью для нас, стенки кишечника покрыты достаточным слоем слизи. А вот судьбе куска мяса, через некоторое время превращающегося в короткие аминокислотные цепочки, не позавидуешь.

Не позавидуешь и поджелудочной железе при остром панкреатите – перекрытый выводной проток или рано активировавшиеся ферменты за сутки способны превратить и саму железу, и ткани вокруг неё в полувязкую кашицу.

Положение усугубляется «лавинообразностью» процесса – по мере повреждения железы в очаг попадает все больше и больше ферментов. Единственный выход – экстренная операция с восстановлением проходимости путей и удалением разлагающихся тканей. В том случае, если основная причина – камень, скальпель уже ничем не заменить, а вот последствия алкоголизма, возможно, в скором времени будут лечить и другим способом.

Авторы публикации в Proceedings of the National Academy of Sciences сумели определить ключевой момент, определяющий внутриклеточное превращение предшественников трипсина в активную форму:

выброс ионов кальция из внутриклеточных депо, обладающих рецепторами к инозитолтрифосфату.

То, что без кальция при панкреатите не обходится, было известно и раньше – этот ион во многих клетках организма выступает в роли активирующего фактора. При этом кальций может как проникать из межклеточного вещества по открываемым трансмембранным каналам, так и выделяться из различных внутриклеточных депо. Если определить местоположение последних, а также пусковые факторы, открывающие «запасники», то можно попробовать вмешаться в процесс с помощью лекарственных средств. Но тут появляется другая проблема – разглядеть эту самую утечку.

Двухфотонная сканирующая лазерная микроскопия

позволяет наблюдать живые ткани на глубине более одного миллиметра, используя феномен флуоресценции. Его преимущества по сравнению с конфокальным микроскопом: большая проникающая способность, низкая степень фототоксичности.

Работа «двухфотонника» основана на физическом принципе, описанном Марией Гёпперт-Майер в её докторской диссертации в 1931 г. Процесс двухфотонного возбуждения происходит следующим образом: два фотона, обладающие низкой энергией, возбуждают флюорофор (способную к флюоресценции молекулу или часть молекулы) в течение одного квантового события. Результатом этого возбуждения является последующее испускание возбужденными молекулами флюоресцентного фотона. Энергия флуоресцентного фотона больше энергии каждого из возбуждающих фотонов.

Поскольку необходимо, чтобы оба фотона возбуждения вступили в контакт с флюорофором в один момент, вероятность того, что оба фотона возбуждения будут поглощены одной молекулой, очень мала. Поэтому необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц).

Двухфотонный микроскоп был впервые сконструирован Винфредом Денком в лаборатории В.В.Вебба в Корнелльском университете. Он скомбинировал идею двухфотонного возбуждения с лазерным сканированием – последовательным «считыванием» информации о свечении в каждом вокселе (единице объема) образца.

То есть все получаемые изображения – во-первых, объемные, а во-вторых – восстановленные (их можно наблюдать только на экране компьютера), и никак нельзя увидеть в сам микроскоп.

Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектр возбуждения в промежутке 400-500 нм, в то время как длина волны возбуждающего лазера находится в промежутке 700-1000 нм (область инфракрасных волн). Если флюорофор поглотит одновременно два фотона, то он получит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Далее возбужденный флюорофор испустит один фотон (в видимой части спектра), длина волны которого зависит от типа флюорофора.

Так как поглощение двух фотонов необходимо для того, чтобы флюорофор перешёл в возбуждённое состояние, вероятность испускания флюорофором вторичного фотона пропорциональна квадрату интенсивности возбуждения. Поэтому флуоресценция будет сильнее в случае, когда луч лазера четко сфокусирован, а не рассеян. Максимальная флуоресценция наблюдается в фокальном объёме (объёме, где сфокусирован луч лазера) и демонстрирует резкое уменьшение в области вне фокуса

Традиционно с этой целью применяются флуоресцирующие агенты, начинающие светиться при наличии двух условий – кальция и возбуждающего света. Но из-за того, что вместо точки на самом деле освещается гораздо больший объем образца, получить картинку хорошего качества очень трудно.

Герасименко и коллеги воспользовались микроскопом с двухфотонным возбуждением –молекула агента светилась только в том случае, если на неё одновременно попадали сразу два фотона возбуждающего света. Во-первых, такой подход минимизирует повреждение самой клетки возбуждающим светом, ведь вместо фотона ультрафиолетового света используются «красные» фотоны. Во-вторых, отсутствует «засвечивание» окружающего объема, что позволяет проследить и локализацию и даже посмотреть работу клеточных депо в динамике.

Выяснилось, что метаболиты спирта способствуют выбросу инозитолтрифосфата (IP₃), а тот, в свою очередь, связывается с рецепторами на «запасниках», из которых уже и выбрасывается кальций, активирующий трипсин.

На этом изыскания британско-японского коллектива не ограничились – они даже нашли два способа заблокировать выброс ионов. Первый, генетический — клетки мышей лишали необходимых рецепторов к IP₃. Второй – блокирование последних с помощью соответствующих моноклональных антител, что больше подходит для внедрения в клиническую практику. Есть и третий вариант – обычный кофеин, который тоже блокирует IP₃-рецепторы.

Проблема лишь в том, что те же самые рецепторы есть и в сердечной, и в скелетной мускулатуре, так что «заигрывание» с ними чревато аритмиями и судорогами. Так что теперь фармакологам придётся заняться проблемами избирательного транспорта в поджелудочную железу.