Эмбриологическими исследованиями в каком-то смысле занимался даже Аристотель, изучавший развитие птичьих яиц. И хотя современная теория индивидуального развития сформировалась лишь в конце XIX века, именно двум тысячам лет истории эмбриологии мы обязаны полноценными «научными» ответами на когда-то «философские» (в худшем смысле этого слова) вопросы о зарождении жизни.
Благодаря эмбрионам мы узнали о существовании программируемой клеточной гибели и направленной миграции. Вершиной же практического применения этой науки, несмотря на многочисленные этические протесты, стало экстракорпоральное оплодотворение и выделение эмбриональных стволовых клеток.
Переход эмбриологии на новый этап развития каждый раз был связан непосредственно с техническим оснащением лаборатории. Сначала вместе с термостатируемыми столиками появилась возможность наблюдать развитие прямо под микроскопом. Потом на смену карандашу, которым пользовался ещё нобелевский лауреат 2002 года по физиологии и медицине Джон Салстон, пришли фото- и видеокамеры — сначала аналоговые, а потом и цифровые. Наконец, на смену обычному рассеянию света пришла флуоресценция, микроманипуляторы сделали возможным внедрение ядер в клетки, а вирусные «векторы» – отдельных генов в находящиеся в ядрах ДНК.
Объединив всё вышеупомянутое и помножив на немецкую скрупулезность, Филипп Келлер и его коллеги
смогли проследить за каждой клеточкой, развивающейся из единственной зиготы модельной рыбки данио (Danio rerio) до состояния зародыша из 20 тысяч клеток – за их появлением, перемещением и делением.
Поскольку в своём эмбриональном развитии люди также проходят стадии, соответствующие своим эволюционным предшествиям («онтогенез повторяет филогенез» по формулировке Геккеля), полученные результаты имеют некоторое отношение и к появлению человека.
Конечно, подобного рода попытки предпринимались и до сегодняшнего дня. Например, любимец генетиков круглый червь Caenorhabditis elegans прозрачен, неприхотлив с точки зрения условий и питания, и его эмбрионы отлично развиваются в лаборатории. Но одно дело 671 достаточно крупная клеточка червя за весь период наблюдения, и совсем другое – тысячи меньших по размеру клеток позвоночных, образующихся уже на первых часах развития.
Теперь представьте, что границы живого эмбриона и так неразличимы даже на большом увеличении микроскопа, так что о наблюдении отдельных клеток без окрашивания и говорить не приходится.
Тут на помощь Келлеру, как и его многочисленным коллегам в течение последнего десятилетия, пришёл ставший в минувшую среду «нобелевским» зеленый флуоресцирующий белок, GFP.
Нобелевские лауреаты по химии 2008 года научили биологов исследовать молекулярные процессы внутри живых организмов. Чтобы узнать, где и в каком количестве появляются молекулы, достаточно посветить на живой организм ультрафиолетовой лампой.
В этом году Нобелевская премия была присуждена за метод изучения биологических молекул.
Ее получили учёные из США – Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсиен (Цянь Юнцзянь) – «за открытие зелёного флуоресцирующего белка (GFP) и разработку методов его применения в науке». Присоединяя кодирующие этот GFP последовательности к встраиваемым в ДНК генам других белков, можно воочию увидеть, когда, где и сколько GFP – а значит, и интересующего нас белка – синтезирует живой организм.
Чтобы понять важность этих работ, достаточно взглянуть на проблемы, с которыми сталкиваются ученые при исследовании живого. Первыми на этом поприще были биохимики, установившие основные принципы работы живых систем и сформулировавшие основы функционирования катаболических и анаболических систем живой клетки. Они же впервые создали теорию ферментов – природных катализаторов чудовищной химической мощности. Во многом этому помогли структурные работы на основе методов γ-резонанса ядер и рентгеноструктурного анализа, позволившие узнать точную структуру белковых молекул в кристаллическом состоянии и в водном растворе.
В процессе познания живого, который шёл, образно говоря, «сверху вниз», во второй половине XX столетия большим подспорьем стали генетические методы, позволившие, в сочетании с новейшими вычислительными технологиями, взглянуть на основы жизни «снизу вверх» – от генов к белкам и их функциям к работе клеток, органов и целых организмов.
Однако ни генетикам, ни биохимикам не удавалось взять живое «живьём».
Ни первые, разглядывая последовательности нуклеотидов, ни вторые, вертящие в руках пластиковую модель белка, не могли до последнего времени взглянуть на работу молекул и тканей с хорошим пространственным и временным разрешением – ни внутри клетки, ни в межклеточном пространстве. А уж о том, чтобы делать какие-то количественные заключения о степени и скорости тех или иных молекулярных биологических процессов, и речи быть не могло.
Методики, делающие такие исследования возможными, появились сравнительно недавно и основываются на пионерских работах Симомуры, начатых на заре шестидесятых годов.
В 1955 году была впервые описана медуза Aequorea victoria, испускающая зеленое хемосинтетическое свечение. Заниматься изучением молекулярного механизма этого свечения выпало Осаму Симомуре, присоединившегося в 1960 году к коллективу принстонской лаборатории Фрэнка Джонсона. До этого Симомура работал в Нагойском университете, где изучал хемилюминесценцию небольших моллюсков остракодов под руководством профессора Хираты.
Разбираясь с флуоресценцией медузы, ученые первоначально наткнулись на белок, дающий синее свечение в присутствии ионов кальция; он получил название экворин. Синее свечение экворина озадачило ученых, так как сама медуза, в которой присутствовал этот белок, светилась зеленым.
Но вскоре после этого был выявлен и источник зелёного свечения, ныне известный под названием «зеленый флуоресцентный белок», GFP. Именно GFP стал «виновником торжества» спустя почти полвека.
Ученые выяснили, что спектр возбуждения GFP совпадает со спектром свечения экворина, и первый, поглощая энергию ультрафиолетового света, испущенного вторым, преобразует её в ходе люминесценции в зеленый свет. Поначалу Симомура гораздо больше заинтересовался экворином, способным стать индикатором присутствия кальциевых ионов в живых системах, но через некоторое время переключился на исследования зеленого белка. В 1979 году он опубликовал статью, посвященную структуре этого природного соединения, и тогда же он корректно установил структурную часть белка, ответственную за хромофорные свойства.
Нобелевский комитет пришел к заключению, что без пионерских работ Симомуры, выполненных с помощью стандартных методик и с фирменным японским усердием, нам пришлось бы ждать революции зеленого флуоресцентного белка еще несколько десятилетий. Возможно, мы бы не дождались её никогда.
Мартин Чалфи подключился к зеленой эстафете сразу после защиты диссертации во время работы в Кембридже. Здесь в начале девяностых судьба свела его с Сидни Бреннером, которому в 2002 году суждено было стать лауреатом «нобелевки» по физиологии и медицине «за открытия в области генетического регулирования развития человеческих органов». Впервые услышав о зеленом флуоресцентном белке и зная о работах Бреннера, Чалфи воодушевился идеей экспрессии генов зеленого флуоресцирующего белка в других живых организмах.
Чалфи стал первым, кому удалось добиться экспрессии GFP в организмах кишечной палочки E.coli и нематоды С.elegans в его «естественной», флуоресцентной форме.
Именно эти работы показали возможность использования белка в качестве универсального генетического маркера. Именно здесь открылась возможность развития методов количественной оценки динамических биологических процессов непосредственно в живой клетке.
Роджер Тсиен присоединился к исследованию сразу после публикаций Чалфи. На рубеже веков он выполнил ряд масштабных работ, в которых смог раскрыть химию флуоресцентных параметров белка и его аналогов. Эти глубокие знания позволили впервые получить модификации белков, светящихся под действием ультрафиолета во всем видимом диапазоне. Его модифицированные белки показали более высокую интенсивность люминесценции и фотостабильность, были улучшены и многие другие характеристики.
После работ Тсиена стало возможно внедрять в живой организм биологические метки сразу несколько типов и раскрашивать интересующие ученых молекулы в самые разные цвета.
Сегодня семейство белков на основе зеленого флуоресцентного является джентльменским набором любого исследователя, сколько-нибудь серьезно занимающегося исследованием процессов в живых системах. Белок нетоксичен для организмов и может быть экспрессирован в больших количествах без влияния на протекания основных биологических процессов. Более того, зеленый белок, «прицепленный» к исследуемой природной молекуле генетически, не влияет на её функциональность, а сама метка сохраняет свою способность к флуоресценции.
В наши дни флуоресцентные белковые метки просто незаменимы при исследовании процессов экспрессии генов, локализации белков и их динамики, взаимодействия между белковыми молекулами, репликации и реорганизации хромосом, изучении транспортных каналов внутри клетки и так далее. Эти работы также спровоцировали развитие множества различных флуоресцентных методик исследования, которые позволили обойти дифракционный предел оптической микроскопии и наблюдать отдельные белковые молекулы в видимом диапазоне.
Теоретически наблюдать все это можно в обычный флуоресцентный или конфокальный микроскоп, но вот разрешающая способность, да и способность отслеживать динамику событий все равно остается недостаточной. Кроме того, конфокальный микроскоп, к примеру, требует достаточно высокой плотности световой энергии в исследуемой точке, которая может привести к повреждению клеток.
Авторам публикации в Science пришлось изобрести более подходящий для своей цели способ, причем не только в микроскопии, но и в обработке изображений.
За счет «возбуждающих» лазерных лучей, двигающихся как горизонтально, так и вертикально, ученые смогли добиться не только высокой разрешающей способности по всем трем осям, но и большей скорости сканирования. В среднем аппарат «анализировал» в секунду 63 миллиона вокселей – элементарных единиц объема (по аналогии с пикселем – элементарной единицы площади). В реальности каждый куб получался из примерно 400 цифровых снимков по 4 мегапикселя каждый (2048 столбцов по 2048 пикселей в каждом); эпизоды сканирования повторялись раз в минуту или полторы минуты.
skin: article/incut(default)
data:
{
"_essence": "test",
"incutNum": 2,
"pic_fsize": "42190",
"picsrc": "Схема работы сканера. Увидеть её в движении можно на этом видеоролике. // P.Keller et al./EMBL",
"repl": "<2>:{{incut2()}}",
"uid": "_uid_2853327_i_2"
}
Изображение, полученное с помощью лазерной сканирующей флуоресцентной тонколистовой микроскопии (так называется новый метод), доступно лишь в цифровом формате – в окуляры микроскопа ничего подобного увидеть невозможно. Отображаемая на мониторе картинка – результат «восстановления» информации компьютером.
Это восстановление по точкам стало для учёных вторым поводом для гордости. Благодаря специально разработанной компьютерной программе им удалось в течение 24 часов непрерывно отслеживать деление, миграцию и превращения тысяч клеток. Всего были получены свыше тысячи кубов данных по 63 миллиона вокселей в каждом. Каждый куб анализировался, по положению флуоресцирующих ядер на соседних кадрах идентифицировались отдельные клетки, их движение и, иногда, деление.
Конечным итогом стало создание «цифрового» эмбриона – компьютерной модели первых суток индивидуального развития, «усредненной» по семи исследованным эмбрионам.
Публике учёные представили три видеоролика, показывающие развитие эмбриона от стадии из чуть более сотни клеток через полтора часа после оплодотворения до уже хорошо различимого зародыша через сутки. На первом из роликов, вынесенном к заголовку статьи, цвета клеток кодируют скорости их перемещения. На втором цветом закодированы направления движения, на третьем синим цветом показаны новые клетки каждого кадра, а красным – только что «поделившиеся» (это разделение, конечно, условно). Обратите внимание на «пульсы» деления ещё почти не отличающихся клеток в самом начале роликов.
В результате оплодотворения яйцеклетки образуется зигота. На стадии морулы и бластулы зигота делится на более мелкие клетки, но объём зародыша при этом не увеличивается. Вначале образуется морула - плотное скопление клеток. при дальнейшем дроблении между клетками появляется полость (бластоцель), зародыш называется бластулой, а его стенка - бластодермой.
На стадии гаструляции клетки зародыша образуют три листка: наружный - эктодерму, средний - мезодерму, внутренний - энтодерму.
Потом материала зародышевых листков образуются осевые зачатки (нервная трубка, хорда, первичная кишка, и др.)
На стадии гисто- и органогенеза из зародышевых листков выделяется мезенхима (источник развития ряда тканей). Тело зародыша обособляется от внезародышевых органов. Из осевых зачатков и из мезенхимы формируются зачатки практически всех органов.
Безусловно, исследовательская группа в скором времени перейдет и к «теплокровным эмбрионам», но новых результатов от Келлера можно ждать и до этого: уже полученное «видео» хранит в себе огромное количество информации, достаточное для доброго десятка публикаций.
