Хоть история искусственного культивирования животных тканей и клеток насчитывает более сотни лет, о практической значимости этого направления биотехнологии врачи задумались сравнительно недавно. Экспериментаторы XIX века, поддерживавшие в разной формы сосудах жизнеспособные ткани, и не предполагали, что через сто лет их последователи научатся выращивать всё это из одной клетки.
Такое стало возможным благодаря открытию Мартином Эвансом эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в 1981 году; в прошлом году это его достижение было отмечено Нобелевской премией по физиологии и медицине. ЭСК способны не только быстро делиться, но и превращаться в клетки всех типов, присутствующие в организме; это свойство называется плюрипотентностью.
Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.
Чуть позже, в 1885 году, Ру показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Впоследствии он стал автором, активно публиковавшимся по проблемам эмбриологии in vitro. Позднее, в 1897 году, Лёб поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. Дополнительные эксперименты были проведены Джолли (1903), наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это при пересадке лимфосаркомной ткани собаки.
Продолжая работы Ру, Росс Харрисон усовершенствовал методику «висячей капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от медуллярного сосуда лягушки к внедренные в ее лимфатический тромб, и выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла, расположенного поверх углубления в предметном стекле. В 1907 году ему удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток составляет 20 мкм за 25 мин. В то время как эксперименты Харрисона были направлены на то, чтобы получить ответы на вопросы, относящиеся к физиологии нервных клеток лягушки, методика, которой он пользовался, была применена Барроузом для других клеток тканей теплокровных животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба использовал тромб плазмы курицы.
В 1913 году Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей. Примененная методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та, которую использовали Левис (1911) и Рид (1908). Рид готовила культуры клеток из костного мозга морской свинки и пыталась выращивать эксплантаты на среде определенного химического состава. Работа Карреля привлекла большое внимание, так как она была опубликована под интригующим названием – культивирование «бессмертных» клеток. Инкубация клеток сердца куриною эмбриона была начала 17 января 1912 года. Пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34 года.
Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл в 1955 году систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях. До тех пор пока в 1961 году Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 удваиваниями популяции.
Перед отмиранием популяции для клеток этой линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это — клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека. Перевиваемая линия карциномы шейки матки была выделена еще в 1952 году Джеем с сотрудниками, она используется и в настоящее время во многих лабораториях мира.
К счастью, пока этих голов почти не касаются вопросы правовые. Клиническое применение эмбриональных стволовых клеток запрещено в большинстве стран, где технологии дошли до того уровня, который может сделать его возможным. И дело здесь не только в этической стороне вопроса, но и в соображениях безопасности:
при выращивании стволовых клеток применяются компоненты животного происхождения, в том числе и из раковых клеток – например, клеток мышиных опухолей.
И хотя эти компоненты не должны попадать в сами ЭСК, риск генетического или, например, вирусного заражения пациента, которому эти клетки будут пересажены, полностью исключить нельзя. До сегодняшнего дня эта опасность оставалась одним из важных аргументов противников трансплантации стволовых клеток. Помимо риска отторжения или злокачественной трансформации вводимых ЭСК или выращенных из них тканей, существует еще фактор «ксеногенности» – влияния продуктов нечеловеческого происхождения.
обладают свойством плюрипотентности, то есть они могут дифференцироваться в любые клетки, из которых состоит организм – клетки эндодермы, мезодермы и эктодермы. Это свойство отличает их от мультипотентных стволовых клеток, которые могут дифференцироваться лишь в различные специализированные клетки того или иного типа.
Тем не менее, из плюрипотентной клетки не может развиться полноценный организм, поскольку из неё не могут появиться клетки, необходимые для такого развития, внешние по отношению к эмбриону – например, клетки плаценты. Клетки, которые могут дифференцироваться и в клетки плаценты называются тотипотентными. В человеческом организме таковой является зигота – продукт слияния яйцеклетки и сперматозоида в процессе оплодотворения, а также клетки двух последующих стадий дифференцировки – бластомеры и эмбриобласты.
Еще один шаг был сделан в конце прошлого года, когда сразу две исследовательские группы сообщили о возможности получения ЭСК без эмбриона – из обычных клеток кожи с помощью небольших генетических манипуляций. Но даже такие «подопечные» не могут обойтись без фидера или геля.
Работа Нобору Сато и его коллег, опубликованная в последнем номере PLoS ONE, позволяет избавиться от животных компонент в среде, в которой выращиваются ЭСК.
Одна из главных проблем культивирования стволовых клеток – как эмбриональных, так и мезенхимальных, получаемых из костного мозга взрослого человека, – состоит в том, что они неизбежно дифференцируются, то есть превращаются в другие клеточные типы. За пару десятилетий способы выращивать ЭСК in vitro («в пробирке») удалось подобрать: помимо определенного состава питательной среды, этим «привередам» необходим так называемый фидер – подложка из инактивированных или мертвых фибробластов кожи мыши или опухолевых клеток.
Следующий этап – специальные гели, позволяющие даже симулировать «подвешенное» состояние. И при производстве этих гелей также не обходится без животных компонентов – их получают из экстракта раковых клеток, от которых, впрочем, оставляют лишь внеклеточный каркас, к которому прикрепляются ЭСК. В таком окружении ЭСК формируют своеобразные колонии, вне которых они попросту не могут существовать, не дифференцируясь в разнообразные клеточные типы.
skin: article/incut(default)
data:
{
"_essence": "test",
"incutNum": 3,
"picsrc": "Так выглядят под микроскопом эмбриональные стволовые клетки человека. В среде с добавлением Y27632 они растут прямо на покрытой поли-D-лизином подложке. Специальный гель для «подвешивания» и формирования трёхмерной колонии им не требуется. //Лаборатория Нобору Сато, Университет Калифорнии в Риверсайде",
"repl": "<3>:{{incut3()}}",
"uid": "_uid_2817811_i_3"
}
Сато и его коллеги предположили, что причина этого – в плотных межклеточных контактах, образованных, в частности, нитями белка миозина. Ученые не стали втупую разрушать «клеточные связи», а разобщили сигнальный каскад Rho-Rock, приводящий к их формированию. В первом эксперименте они воспользовались обратимым, а потому потенциально безопасным эффектом РНК-интерференции, а затем даже подобрали химическое вещество с рабочим названием Y27632, которое выполняет ту же функцию.
Эмбриональным стволовым клеткам, связи между которыми разрушены, ни подложка из раковых клеток, ни гели не нужны.
И хотя на «голом» пластике ЭСК все равно жить не захотели, оказалось достаточным покрыть чашки поли-D-лизином, который, в отличие от неизвестных компонентов фидера, не представляет из себя никакой опасности. Как отмечают ученые, ни структура, ни функции человеческих ЭСК от этого не пострадали: они сохранили как способность к делению, так и свойство плюрипотентности – умение превращаться во все клетки нашего организма. Так что арсенал биотехнологов пополнился хорошим инструментом.
Правда, от всех животных продуктов «культуральщики» избавятся не скоро, и будет это довольно дорого.
В подавляющем большинстве случаев в среду добавляют ещё и телячью сыворотку, содержащую белки и факторы роста в нужной пропорции. Собрать что-то подобное из «чистых» составляющих возможно, но это приведет минимум к десятикратному удорожанию процедуры.
Поскольку Сато и его коллеги с самого начала «замахнулись» на человеческий биологический материал, то уже в скором времени стоит ждать немало экспериментальных работ с использованием этого метода. А там, глядишь, дойдёт дело и до практического применения – если метод покажет себя безопасным, а законы изменятся. Правда, этической проблемы работа Сато не снимает.
