Весь прошлый год регулярно выходили сообщения наподобие «открыт ген тучности», «ожирение вызывается нарушением работы гена». Научно-популярные издания, в том числе и наше, не уставали информировать читателя об этих открытиях. Журнал Science, подводя итоги года, назвал эти исследования, как и другие, посвященные детализации работы генома, «прорывом года».
Такое пристальное внимание к «генам ожирения» объясняется не только банальным желанием похудеть или свалить вину за нежелание поддерживать себя в хорошей форме на «плохую наследственность». К числу заболеваний, тесно связанных с ожирением, относятся сердечно-сосудистые, диабет, прочие эндокринные расстройства и болезни обмена веществ. Так что системы здравоохранения всех, а особенно развитых стран более чем заинтересованы в поиске причин, а возможно, методов профилактики и лечения тучности.
Возможно, это не такая простая задача. Как показало последнее исследование, вес тела и его конституция активно определяется работой и продуктами более чем 6 тысяч генов.
Такой результат получили ученые из исследовательского центра имени Монелла, подсчитавшие, сколько именно генов способны повлиять на массу тела. В аспекте соответствующей эпидемии в США и других развитых странах их работа более чем актуальна.
Обычно о роли того или иного гена в определенном процессе можно сделать вывод на основании двух признаков.
Первый способ – изучение распределения аллелей (вариантов этого гена) в геноме человеческих популяций. Параллельно с этим проводится исследование интересующих ученых параметров, в данном случае – массы, роста и веса, но можно также документировать частоту различных заболеваний, хоть цвет глаз (правда, гены, определяющие окраску глаз, уже давно выяснены).
(от греческого «взаимный») – различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. Если эти формы совпадают, то особь гомозиготна по этому аллелю, если не совпадают – гетерозиготна. В обычной диплоидной клетке тела может существовать не больше двух аллелей одного локуса одновременно, в гамете – один.
Во втором случае действительно можно говорить о конкретном действии того или иного гена. Правда, единственный способ сделать это – выключить соответствующий ген. Естественно, такую работу можно провести только на мышах. В результате работы генетиков с эмбриональными стволовыми клетками и получаются «нокаутные животные». За «изобретение» которых и была вручена последняя Нобелевская премия по физиологии и медицине. Именно такой подход считается «золотым» стандартом в оценке эффектов того или иного гена. И именно так, кстати, регулярно доказывается влияние того или иного гена на ожирение.
Метод нокаута генов позволяет получать линии нокаутных мышей (knock-out mice, knockout mice) — мутантных мышей, у которых выключены определенные гены. Этот метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и в его нормальной и патологической работе и изучать различные человеческие болезни, используя мышей в качестве модельных объектов. Выключенный ген приводит к тем или иным нарушениям. Характер этих нарушений позволяет судить о функциях данного гена. С тех пор как эта методика была разработана, ее применение позволило создать тысячи различных линий нокаутных мышей, из которых несколько сотен служат модельными объектами для изучения человеческих болезней, в частности заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем и злокачественных опухолей.
В основе метода лежит явление гомологичной рекомбинации — обмена соответствующими участками между парами гомологичных хромосом. Марио Капекки и Оливер Смитис независимо друг от друга изобрели способ выключения (нокаутирования) генов за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, имеющих определенную последовательность нуклеотидов, соответствующую участку одного из генов, но некоторым образом видоизмененную. Такие фрагменты вводят в выращиваемые в культуре (то есть в искусственной среде отдельно от организма) клетки посредством электропорации — через поры в клеточной мембране, созданные искусственно с помощью электрического поля. За счет рекомбинации в некоторых из клеток культуры введенная последовательность внедряется в хромосому на место нормальной.
Если видоизменить внедряемую последовательность определенным образом, то на основе испорченного таким образом гена у получивших этот ген клеток будет синтезироваться нефункциональный (не выполняющий своей функции) белок, или вообще не будет синтезироваться никакого белка. Если видоизменить исходную последовательность, не только испортив некоторый ген, но и добавив другой ген, не свойственный мышиным клеткам и делающий их устойчивыми к действию некоторого антибиотика, рекомбинантные клетки можно легко отделить от остальных, подействовав на культуру данным антибиотиком, и получить таким образом культуру рекомбинантных клеток. Капекки и Смитис научились выключать с помощью этого метода гены в культурах клеток, но разработанная ими технология еще не позволяла получать нокаутные многоклеточные организмы.
Мартин Эванс, который около 1980 года одним из первых разработал способ выращивания в культуре эмбриональных стволовых (недифференцированных) клеток мышей, впоследствии изобрел метод, позволяющий передавать определенные гены потомству мышей, этими генами не обладающих. Он вводил стволовые клетки, полученные из эмбрионов мышей одной линии, в эмбрионы мышей другой линии и, используя какую-либо мышь в качестве суррогатной матери, вынашивающей эти эмбрионы, получал химерных мышей (состоящих из клеток, полученных от разных организмов). У некоторых из них предшественники гамет (половых клеток) были потомками инъецированных в эмбрионы стволовых клеток. Потомству таких химер доставались гены той линии, от которой были взяты стволовые клетки. Отбирая потомков химер, обладающих признаками этой линии, Эванс получил мышей, генетически идентичных инъецированным ранее в эмбрионы стволовым клеткам.
Затем Эванс модифицировал этот метод для получения трансгенных мышей (то есть мышей с искусственно внедренными генами), добавляя гены в хромосомы инъецируемых стволовых клеток c помощью ретровирусов (вирусов, гены которых встраиваются в хромосомы клеток хозяина). Потомки химер, полученных таким способом, если у этих химер предшественники половых клеток образовывались из инъецированных в эмбрион стволовых клеток, оказывались носителями внедренного в стволовые клетки гена.
Достижения Эванса сделали возможным создание мышей, у которых определенный ген был бы выключен посредством нокаутирования за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, то есть объединив метод Эванса с методом Капекки и Смитиса — нокаутируя гены в инъецируемых в эмбрион стволовых клетках. Именно в лабораториях Капекки и Смитиса (снова независимо, и в разных вариантах) подобный модифицированный метод и был впервые применен на практике, положив начало множеству работ с нокаутными мышами.
Схема получения нокаутных мышей. В эмбриональные стволовые клетки мышей некоторой чистой (то есть генетически однородной) линии (в данном случае — черного цвета) вводят фрагмент ДНК, содержащий мутантный (поврежденный) ген. Этот фрагмент встраивается в хромосомы — нередко только в одну из двух гомологичных хромосом клетки. Полученные мутантные стволовые клетки вводят в зародыши мышей другой линии (в данном случае — бурых) на ранней стадии развития и имплантируют эти зародыши в организм суррогатной матери. Рождаются химерные мыши, некоторые из которых (те, у кого предшественники половых клеток развились из инъецированных стволовых клеток) производят исключительно черное потомство. Если у каждой из таких мышей мутантный ген имеется в одной из двух гомологичных хромосом, то, в соответствии с менделевским расщеплением, приблизительно половину их потомства составят носители мутантного гена, а четверть — гомозиготы, имеющие мутантный ген в обеих хромосомах пары и, соответственно, не имеющие ни одной копии нормального (неповрежденного) гена. Потомство таких гомозигот будет чистой линией мышей, нокаутных по данному гену.
Применение метода нокаута генов стало особенно актуальным в последние годы, после завершения секвенирования (прочтения последовательности) полных геномов как человека (2003), так и мыши (2002), а также ряда других видов животных. Последовательно нокаутируя различные гены в пределах мышиного генома, исследователи выясняют функции каждого из них. Учитывая, что у человека и мыши очень многие гены сходны и выполняют одни и те же функции, нокаутные мыши предоставляют исследователям богатый материал для изучения роли генов в нормальном развитии и жизни человеческого организма и в патологических процессах. По-видимому, рано или поздно благодаря методу нокаута генов удастся изучить свойства всех (нескольких десятков тысяч) генов мышиного генома. Работы в этом направлении ведутся во многих странах мира, не исключая и Россию.
Метод нокаута генов можно применять не только на мышах, но и на других животных. Однако именно нокаутные мыши нашли особенно широкое применение — в связи с тем, что они эволюционно (и, соответственно, генетически) довольно близки к человеку, а получить нокаутные линии у них намного проще, чем у большинства других лабораторных животных. В частности, у крыс первые нокаутные линии были получены только в 2003 году, через много лет после создания первых нокаутных мышей.
Зачастую вес животных не интересует ученых, которые создают новую линию мышей для других целей, например, определения роли генов в работе нервной системы или в развитии опухолей. Но характеристики линии, среди которых продолжительность жизни и вес взрослой особи, обязательно документируются.
Стоит отметить, что нокаутные мыши получаются из линий животных, все особи которых обладают абсолютно идентичным геномом. А потому такие показатели как вес, число потомков, цвет шерсти и тому подобные более чем стабильны.
Воспользовавшись, в некотором смысле, «чужими результатами», Тордофф и его коллеги заметили, что 31% создаваемых мышей весили меньше своих собратьев (тот есть отсутствовавший ген повышает массу тела), а 3% — больше (отсутствующий ген приводит к понижению массы тела). Если умножить 0,3 и 0,03 на общее число генов в мышином геноме, то получится около 6 тысяч – именно столько генов, как полагают авторы, и участвует в регуляции веса тела.
Можно сказать, что найдено очередное оправдание тем, кому лень дойти до тренажёрного зала.
Гораздо легче набрать вес, чем сбросить. Ведь за повышение массы тела отвечает в 10 раз больше генов, чем за понижение.
Даже если сделать поправку на то, что сейчас немалая часть нокаутных мышей создается именно для исследований веса тела, все равно предполагаемое число «мишеней» для генной терапии ожирения останется не меньше 3–4 тысяч, а это около пятой части всего генома.
Но это исследование ни в коей мере не умаляет важности уже проведенных и проводимых работ, изучающих «гены ожирения». Ведь это всего лишь прогноз, который даже не предложил новых генов для исследования, а статьи, в названии которых фигурирует «ген тучности», постепенно приоткрывают завесу над работой человеческого генома. Хотя он и был секвенирован к 2001 году, роль большинства генов до сих пор неизвестна.
